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02-04 2021

MSC來源的sEVs的治療應(yīng)用

發(fā)布者:本網(wǎng)站 瀏覽次數(shù):1790


    間充質(zhì)干細(xì)胞是干細(xì)胞家族的重要成員,來源于發(fā)育早期的中胚層,屬于多能干細(xì)胞,間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下具有多向分化潛能,可用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。但現(xiàn)在越來越多的研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細(xì)胞的功能作用主要是由旁分泌因子介導(dǎo)的。此外,很多證據(jù)表明,MSCs通過釋放胞外囊泡(EVs)發(fā)揮許多大部分的旁分泌作用,特別是Small EVs(直徑50-200nm),sEVs可以從不同培養(yǎng)條件培養(yǎng)的MSCs培養(yǎng)上清中獲得,很多文獻(xiàn)報(bào)道其具有很好治療效果。因此,MSC-sEVs被認(rèn)為是很有前途的治療藥物,并被推薦用于臨床試驗(yàn)。但是,MSC-sEVs的來源和分離方法具有多樣性,需要有明確的驗(yàn)證的指標(biāo)和功能分析來更好地制備標(biāo)準(zhǔn)的MSC-sEV。



      將MSC-sEVs實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵是MSC,MSC已經(jīng)在臨床中進(jìn)行了大量的試驗(yàn),并已證明其安全性。迄今為止,已有近1000項(xiàng)臨床試驗(yàn)被注冊,包括骨髓(BM)、脂肪組織(AD)、臍帶血(CB)等來源的MSC。然而,到目前為止,只有少數(shù)MSC產(chǎn)品被批準(zhǔn)上市。這可能與某些臨床試驗(yàn)中沒有觀察到明顯的治療效果以及不同實(shí)驗(yàn)室制備的MSC產(chǎn)品的異質(zhì)性有關(guān)。為了推進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞在治療領(lǐng)域的發(fā)展,國際細(xì)胞與基因治療學(xué)會(ISCT)將人間充質(zhì)干細(xì)胞的基本特征提煉為一套最低的建議標(biāo)準(zhǔn)。


*第一:MSC在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下保持貼壁。
*第二:MSC必須表達(dá)CD105、CD73和CD90,并且不表達(dá)CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79alpha或CD19和HLA-DR表面分子。
*第三MSC必須能夠在體外向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞分化。
      ISCT對MSC的定義是非常有用的,可以作為界定MSC的參考標(biāo)準(zhǔn),然而,這些標(biāo)準(zhǔn)僅僅代表了一個(gè)基本的定義,它更多的是用來消除非MSC的細(xì)胞,而且,這些基本參數(shù)是在2006年建立的,沒有包含MSC的治療效力相關(guān)的生物活性、作用機(jī)制等內(nèi)容,比如免疫調(diào)節(jié)、抑制纖維化、促進(jìn)鄰近細(xì)胞的增殖或EVs的釋放等。根據(jù)最初的標(biāo)準(zhǔn),很難預(yù)測間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效力,所以需要進(jìn)行更多的研究,以豐富MSC的定義標(biāo)準(zhǔn)。


      越來越多的人認(rèn)識到,在不同的臨床應(yīng)用中,MSCs的生物學(xué)活性會有所不同,因此,我們應(yīng)該更多的關(guān)注其生物活性,而不是傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)。為MSCs定義細(xì)胞類型不同于定義sEVs的來源。例如,長時(shí)間培養(yǎng)MSCs可能會破壞其分化潛能,但不會損害其衍生的sEVs的治療效果。所以如果要證明MSC為MSC-sEVs的細(xì)胞來源,需要的最少信息包括:


證明MSC-sEVs的最少信息:

*(1)分離MSCs的組織來源說明(CB、AD、BM)。
*(2)確認(rèn)三種譜系潛能中至少一種,要區(qū)分MSC與成纖維細(xì)胞,成纖維細(xì)胞具有許多間充質(zhì)干細(xì)胞的特征,但似乎缺乏治療活性。

*(3)源細(xì)胞需要注明 (原代或經(jīng)修飾的MSC)。
*(4)最后的MSC-sEVs制劑的功能測試,以確定MSC是否有能力產(chǎn)生功能性sEVs。



    EV通常包括為外泌體、微囊泡及凋亡小體等囊泡,對于外泌體還沒有一個(gè)嚴(yán)格的定義。外泌體通常指由內(nèi)體形成的一類特殊的sEV,不同于從質(zhì)膜上以出芽的形式分泌的EV(微囊泡、微粒子)。雖然外泌體通常被認(rèn)為比微囊泡小,但這兩種EV類型不能僅根據(jù)大小來區(qū)分,因?yàn)樗鼈兏髯缘拇笮》秶怯兄丿B的。所以要制備一個(gè)純的MSC-sEVs制劑,需要一套完整分離和鑒定方案,才能排除掉非內(nèi)體來源囊泡的干擾。
      由于目前還無法利用EV的生物生成對EV進(jìn)行分離,因此外泌體的命名比較推薦使用sEVs這個(gè)術(shù)語,sEVs也源于最近提出的根據(jù)物理特性或分離方法對EV進(jìn)行分類的建議。例如,經(jīng)過0.22um過濾器或100000xg超速離心獲取的EV通常直徑小于200nm,可歸類為sEVs。雖然這樣分類提供很少EV的生物學(xué)信息,但它很實(shí)用,因?yàn)樗x了一個(gè)可以進(jìn)行制備的EV種群。因此可以使用MSC small EVs (MSC-sEVs),來描述由MSC釋放的,直徑為50-200nm的,雙層膜囊泡。

      MSC-sEVs生產(chǎn)的過程是MSC-sEV制劑標(biāo)準(zhǔn)化的主要考慮因素。要想實(shí)現(xiàn)MSC-sEVs臨床應(yīng)用,一個(gè)GMP級的生產(chǎn)過程是非常必要的。生產(chǎn)步驟的選擇取決于所需要的批量大小,并且sEVs的純度、一致性、安全性和穩(wěn)定性等評價(jià)指標(biāo),必須通過質(zhì)量測試并加以確認(rèn)。 



 生物反應(yīng)器培養(yǎng):
   在細(xì)胞培養(yǎng)中,細(xì)胞密度可影響細(xì)胞行為和分泌物的性質(zhì)。據(jù)報(bào)道,在較低密度下接種的細(xì)胞,細(xì)胞會產(chǎn)生更多的sEVs。所以為了能夠大規(guī)模生產(chǎn)MSC-sEV,生物反應(yīng)器是很理想的設(shè)備。目前有三種主要的生物反應(yīng)器類型,每一種都對生產(chǎn)MSC-sEVs產(chǎn)生獨(dú)特的影響:
2D表面的生物反應(yīng)器
基于中空纖維的生物反應(yīng)器
攪拌罐生物反應(yīng)器 (必須在微載體上培養(yǎng)MSC)
    雖然三種生物反應(yīng)器都已用于MSC制備,但它們對sEV生產(chǎn)及功能的影響需要進(jìn)一步研究。即使細(xì)胞在靜態(tài)下的培養(yǎng)條件完全成熟,也不能立馬轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器中,必須要再優(yōu)化培養(yǎng)條件。3D生物反應(yīng)器更有利于MSC的培養(yǎng),因?yàn)樗梢员O(jiān)測細(xì)胞數(shù)量、生存能力、形態(tài)和增殖,并提供更均勻的營養(yǎng)和氧氣的分布。
細(xì)胞培養(yǎng)基成分:
    MSC在胎牛血清(FBS)為能量來源的培養(yǎng)基中很容易生長,但是,為了促進(jìn)MSC-EV在治療應(yīng)用的發(fā)展,至少應(yīng)該在sEV生產(chǎn)制備階段消除異種成分。因此,可以用人血清或血小板裂解液(hPL)來替代FBS。但與FBS一樣,人血清和hPL本身都含有EV或EV樣顆粒,它們可以與MSCs產(chǎn)生的sEVs共同被純化。這些外源性EVs可能是安全的,因?yàn)楦缓珽Vs的輸血產(chǎn)品大都是安全。但事實(shí)上,目前尚無證據(jù)表明hPL-EV對MSC-EV制劑的治療作用是否負(fù)性影響,而且外源性的sEVs或非sEVs顆??赡軙档突蜃钄郙SC-sEVs的某些作用。因此,確定外源性囊泡與MSC-sEVs在治療作用上的關(guān)系是非常有必要的。



超速離心法:

     超速離心法是目前應(yīng)用最廣泛的EV富集方法。然而,超離心法有幾個(gè)缺點(diǎn)。超離心法不能產(chǎn)生高純度的sEVs,雖然系列洗滌可以提高純度,但同時(shí)也會降低產(chǎn)量。有報(bào)道稱超離后的sEV有聚集的現(xiàn)象,影響其電鏡下的形態(tài)。最重要的是,超速離心由于儀器的限制,不能高通量提取,且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。所以超速離心不可能對MSC-sEV進(jìn)行大規(guī)模純化。
商業(yè)試劑盒提取
     近年來,隨著EV研究領(lǐng)域的發(fā)展,針對EV的商業(yè)產(chǎn)品數(shù)量激增。雖然這些產(chǎn)品中的一些已被認(rèn)可,甚至潛在的符合GMP,但對許多產(chǎn)品來說,分離方法的原理并沒有被闡明,而且一些專有試劑的成分也不為人所知。除非產(chǎn)品的原理及操作已證明符合GMP要求,且商業(yè)試劑盒供應(yīng)商披露了專有試劑成分,并評估該成分的臨床可用性和安全性,否則使用此類試劑盒生產(chǎn)臨床級的sEVs是不現(xiàn)實(shí)的。
聚乙二醇聚合物沉淀:
      用聚乙二醇(PEG)或其他聚合物“鹽析”沉淀是減少樣本體積,達(dá)到濃縮目的的有效方法,而且樣本處理量很大,一次可以提取幾升細(xì)胞上清的EV,且操作簡單,只需要低速離心就可以獲得大量的EV,但是,聚乙二醇沉淀的EV中含有大量的共沉淀物,PEG沉淀不能獲得純凈的EV。然而,PEG-沉淀的MSC-sEVs已經(jīng)用于臨床研究,PEG濃縮的MSC-sEVs在缺血性腦卒中模型中的作用與相應(yīng)的MSC效果相同。因此,PEG沉淀似乎不會干擾MSC-sEV活性。
依據(jù)顆粒大小分離:
      基于EV粒徑大小的分離方法,如尺寸排阻色譜法(SEC)和切向流過濾法(TFF),被越來越受到研究人員的認(rèn)可。與傳統(tǒng)方法相比,這些方法更容易實(shí)現(xiàn),同時(shí)還可以生產(chǎn)高純度的EV和而且不影響其生物活性,所以SEC和TFF被認(rèn)為是高產(chǎn)高效的EV提取方法,其生產(chǎn)流程更容易標(biāo)準(zhǔn)化,適合GMP級的EV的生產(chǎn)。



      我們目前對MSC-sEVs的定義僅僅傳達(dá)了EV的特性和生物完整性,并不能預(yù)測其治療效果。因此,開發(fā)一系列可定量、可靠的能夠預(yù)測MSC-EVs治療效力的的指標(biāo)是十分必要的。檢測MSC-sEV的治療活性也需要對MSC-sEV生物學(xué)有深入的了解,例如正常和病變狀態(tài)下MSC-sEVs的半衰期和體內(nèi)生物分布,以及對不同組織的直接或間接靶向等內(nèi)容。因此,定義MSC-sEV制劑的治療效能需要更深層次的討論,這也是SOCRATES、ISCT、ISEV和ISBT未來探索的主題。


文章來源:
Defining mesenchymal stromal cell (MSC)-derived small extracellular vesicles for therapeutic applications. Journal Extracellular Vesicles. 2019