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10-17 2023

知識(shí)梳理||什么是外泌體?

發(fā)布者:本網(wǎng)站 瀏覽次數(shù):890

外泌體(Exosomes)是一種微小的細(xì)胞分泌泡,直徑約為30-150納米。它們由各種細(xì)胞釋放,并攜帶多種生物活性物質(zhì),如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)。外泌體通過(guò)血液循環(huán)或細(xì)胞間接觸,用于細(xì)胞間通訊和信息交換。它們?cè)诙喾N生物進(jìn)程中發(fā)揮重要作用,如免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)展和神經(jīng)傳導(dǎo)。


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外泌體樣本預(yù)處理與分離、保存


外泌體存在于人類(lèi)或動(dòng)物的各種體液中,我們可以選擇不同的樣本來(lái)源進(jìn)行相關(guān)的外泌體研究。由于外泌體是來(lái)源于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷的含有脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)的多泡小體,分布于胞外基質(zhì)。為了獲得高純度的外泌體,必須確保有效去除所有的細(xì)胞碎片及其他不需要的雜質(zhì)。



不同的實(shí)驗(yàn)樣本采集時(shí)需要注意的地方不一樣,如細(xì)胞培養(yǎng)上清在收集樣本前需換成無(wú)外泌體血清培養(yǎng)、血漿樣本采集時(shí)用一定不能用肝素抗凝管、尿液收集時(shí)需要加抑菌劑等。


從生物體液中分離外泌體的各種方法已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái),主要根據(jù)外泌體的大小、密度、免疫特性等特點(diǎn)進(jìn)行操作,目前差速超速離心是外泌體分離方法中公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。


外泌體超離大致步驟



外泌體鑒定:


外泌體分離之后,需要經(jīng)過(guò)一系列鑒定才能確定分離的是外泌體。鑒定方法從物理特征到表面分子標(biāo)志物,多角度進(jìn)行鑒定。


(1)透射電鏡鑒定法:簡(jiǎn)稱(chēng)TEM,適合外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察,即通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形。

外泌體透射電鏡


(2)納米顆粒跟蹤分析法:簡(jiǎn)稱(chēng)NTA,該方法能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測(cè)速度快,檢測(cè)后能提供外泌體粒徑和濃度信息。

外泌體NTA圖


(3)Western blot分子標(biāo)志物檢測(cè):外泌體標(biāo)志蛋白包括四跨膜蛋白家族,如CD9、CD63和CD81;細(xì)胞質(zhì)蛋白,如肌動(dòng)蛋白(Actin)和鈣磷脂結(jié)合蛋白(Annexins);參與生物功能的分子,如凋亡轉(zhuǎn)接基因2互作蛋白X(ALIX)、腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)、熱休克蛋白(HSP70、HSP90),以及細(xì)胞分泌的特異性蛋白。

外泌體Western Blot圖


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外泌體高通量檢測(cè)


外泌體內(nèi)含有與細(xì)胞來(lái)源相關(guān)的蛋白質(zhì)和核酸,可以運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等進(jìn)入受體細(xì)胞,參與細(xì)胞間通訊。不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體所含有的蛋白成分和RNA不太相同,可作為多種疾病的早期診斷標(biāo)記物,也能作為靶向藥物的載體進(jìn)行疾病治療。


1. miRNA高通量測(cè)序

2. 表達(dá)譜芯片(人、小鼠)

3. lncRNA芯片(人、小鼠)

4. ceRNA芯片(人、小鼠)

5. 蛋白質(zhì)組分析(iTRAQ、TMT、Label-free)



外泌體示蹤


對(duì)分離的外泌體進(jìn)行體外標(biāo)記或活體示蹤,有助于對(duì)外泌體的功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究。目前常用親脂性染料對(duì)外泌體進(jìn)行標(biāo)記,親脂性染料主要包括兩類(lèi),一是PKH67(綠色)和PKH26,二是DiI(橙色熒光)、DiO(綠色熒光)、DiD(紅色熒光)、DiR(深紅色熒光)。




外泌體的功能研究


觀(guān)察外泌體具有哪些功能,可以將外泌體直接加入受體細(xì)胞培養(yǎng)基中,與受體細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),觀(guān)察細(xì)胞的功能變化,或者將外泌體注射入動(dòng)物模型中,觀(guān)察動(dòng)物表型變化和檢測(cè)動(dòng)物相關(guān)指標(biāo),如腫瘤轉(zhuǎn)移、血糖水平、胰島素敏感性等。




結(jié)語(yǔ)


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