基因HVBO||敲除細(xì)胞株(系)構(gòu)建，用質(zhì)粒？慢病毒？還是RNP法？
眾所周知，CRISPR-Cas9作為一項基因編輯技術(shù)，目前已經(jīng)是生命科學(xué)領(lǐng)域家喻戶曉的技術(shù)了。但雖說這項技術(shù)非?；鸨?，仍有許多同學(xué)對基因編輯技術(shù)存在理解偏差，比如最常見的，在應(yīng)用CRISPR-Cas9構(gòu)建基因敲除（KO）細(xì)胞系，到底采用質(zhì)粒法、病毒法還是有其他更好的方法呢？
★慢病毒法★
指通過包膜蛋白與細(xì)胞表面受體結(jié)合的方式感染細(xì)胞。即慢病毒與宿主細(xì)胞膜融合后釋放結(jié)構(gòu)蛋白、酶蛋白和病毒基因組。病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄并與整合酶形成整合前復(fù)合物。整合前復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核后，整合酶催化其整合至宿主基因組。具體方法是將包裝質(zhì)粒、穿梭質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48-72 h收集病毒上清，通過離心、過濾、濃縮、分裝和滴度檢測，進(jìn)而感染靶細(xì)胞。此方法會引入外源基因，影響其他基因表達(dá)，并且存在脫靶效應(yīng)。
圖1.慢病毒法原理圖
但是，慢病毒感染存在著兩個比較關(guān)鍵的問題：
1. 利用慢病毒法轉(zhuǎn)染Cas9會在敲除靶基因的同時引入新的基因，而且慢病毒轉(zhuǎn)染的外源基因是隨機(jī)整合，存在影響其他基因表達(dá)的風(fēng)險。
2. CRISPR-Cas9編輯過程存在脫靶效應(yīng)，慢病毒法會持續(xù)表達(dá)Cas9蛋白，長期存在的Cas9蛋白會對這種脫靶效應(yīng)有累積效應(yīng)，最終影響實(shí)驗的嚴(yán)謹(jǐn)性。
圖2. 慢病毒感染進(jìn)行基因敲除
★質(zhì)粒法★
將Cas9和sgRNA表達(dá)載體，通過瞬時轉(zhuǎn)染的方式感染靶細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)翻譯出Cas9蛋白，與轉(zhuǎn)錄的sgRNA結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞核對基因組進(jìn)行編輯。具體方法是將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫靜置，轉(zhuǎn)染體系加入靶細(xì)胞培養(yǎng)，再進(jìn)行單克隆篩選、單克隆擴(kuò)增、qPCR檢測等。由于質(zhì)粒整合到基因組的概率很低，隨著細(xì)胞傳代質(zhì)粒載體會逐漸消失，感染效率逐漸降低。
圖3.質(zhì)粒法原理圖
★RNP法★
與質(zhì)粒法不同的是，RNP法是通過電刺激轉(zhuǎn)染的方法直接將Cas9蛋白和sgRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。由于Cas9蛋白是不帶電荷的，而sgRNA是帶電荷的，因此只有當(dāng)Cas9與sgRNA結(jié)合后，才能更高效的將兩者轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。同時，由于Cas9和sgRNA會被降解，Cas9-sgRNA復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的存留時間不會很長，因此發(fā)生脫靶的概率很低，但相應(yīng)的切割效率也可能有一定降低。
圖4.RNP轉(zhuǎn)染原理圖
圖2. Cas9蛋白與gRNA形成RNP復(fù)合物
從國內(nèi)外文獻(xiàn)報道的情況來看，質(zhì)粒法和RNP法是目前主流的基因敲除策略，對于課題組實(shí)驗室而言，質(zhì)粒法可能更容易實(shí)施，而對于生物技術(shù)企業(yè)，RNP法則具有更高的實(shí)驗效率。但這兩種不同的方法只是殊途同歸，只要能達(dá)到敲除效果的就是好方法。
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