MSC來源的sEVs的治療應用
間充質干細胞是干細胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層，屬于多能干細胞，間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下具有多向分化潛能，可用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。但現(xiàn)在越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，間充質干細胞的功能作用主要是由旁分泌因子介導的。此外，很多證據(jù)表明，MSCs通過釋放胞外囊泡(EVs)發(fā)揮許多大部分的旁分泌作用，特別是Small EVs(直徑50-200nm)，sEVs可以從不同培養(yǎng)條件培養(yǎng)的MSCs培養(yǎng)上清中獲得，很多文獻報道其具有很好治療效果。因此，MSC-sEVs被認為是很有前途的治療藥物，并被推薦用于臨床試驗。但是，MSC-sEVs的來源和分離方法具有多樣性，需要有明確的驗證的指標和功能分析來更好地制備標準的MSC-sEV。
將MSC-sEVs實現(xiàn)臨床轉化的關鍵是MSC，MSC已經(jīng)在臨床中進行了大量的試驗，并已證明其安全性。迄今為止，已有近1000項臨床試驗被注冊，包括骨髓(BM)、脂肪組織(AD)、臍帶血(CB)等來源的MSC。然而，到目前為止，只有少數(shù)MSC產(chǎn)品被批準上市。這可能與某些臨床試驗中沒有觀察到明顯的治療效果以及不同實驗室制備的MSC產(chǎn)品的異質性有關。為了推進間充質干細胞在治療領域的發(fā)展，國際細胞與基因治療學會(ISCT)將人間充質干細胞的基本特征提煉為一套最低的建議標準。
*第一：MSC在標準培養(yǎng)條件下保持貼壁。
*第二：MSC必須表達CD105、CD73和CD90，并且不表達CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79alpha或CD19和HLA-DR表面分子。
*第三：MSC必須能夠在體外向成骨細胞、脂肪細胞和成軟骨細胞分化。
ISCT對MSC的定義是非常有用的，可以作為界定MSC的參考標準，然而，這些標準僅僅代表了一個基本的定義，它更多的是用來消除非MSC的細胞，而且，這些基本參數(shù)是在2006年建立的，沒有包含MSC的治療效力相關的生物活性、作用機制等內容，比如免疫調節(jié)、抑制纖維化、促進鄰近細胞的增殖或EVs的釋放等。根據(jù)最初的標準，很難預測間充質干細胞的治療效力，所以需要進行更多的研究，以豐富MSC的定義標準。
越來越多的人認識到，在不同的臨床應用中，MSCs的生物學活性會有所不同，因此，我們應該更多的關注其生物活性，而不是傳統(tǒng)的標準。為MSCs定義細胞類型不同于定義sEVs的來源。例如，長時間培養(yǎng)MSCs可能會破壞其分化潛能，但不會損害其衍生的sEVs的治療效果。所以如果要證明MSC為MSC-sEVs的細胞來源，需要的最少信息包括：
證明MSC-sEVs的最少信息：
*（1）分離MSCs的組織來源說明(CB、AD、BM)。
*（2）確認三種譜系潛能中至少一種，要區(qū)分MSC與成纖維細胞，成纖維細胞具有許多間充質干細胞的特征，但似乎缺乏治療活性。
*（3）源細胞需要注明 (原代或經(jīng)修飾的MSC)。
*（4）最后的MSC-sEVs制劑的功能測試，以確定MSC是否有能力產(chǎn)生功能性sEVs。
EV通常包括為外泌體、微囊泡及凋亡小體等囊泡，對于外泌體還沒有一個嚴格的定義。外泌體通常指由內體形成的一類特殊的sEV，不同于從質膜上以出芽的形式分泌的EV(微囊泡、微粒子)。雖然外泌體通常被認為比微囊泡小，但這兩種EV類型不能僅根據(jù)大小來區(qū)分，因為它們各自的大小范圍是有重疊的。所以要制備一個純的MSC-sEVs制劑，需要一套完整分離和鑒定方案，才能排除掉非內體來源囊泡的干擾。
由于目前還無法利用EV的生物生成對EV進行分離，因此外泌體的命名比較推薦使用sEVs這個術語，sEVs也源于最近提出的根據(jù)物理特性或分離方法對EV進行分類的建議。例如，經(jīng)過0.22um過濾器或100000xg超速離心獲取的EV通常直徑小于200nm，可歸類為sEVs。雖然這樣分類提供很少EV的生物學信息，但它很實用，因為它定義了一個可以進行制備的EV種群。因此可以使用MSC small EVs (MSC-sEVs)，來描述由MSC釋放的，直徑為50-200nm的，雙層膜囊泡。
MSC-sEVs生產(chǎn)的過程是MSC-sEV制劑標準化的主要考慮因素。要想實現(xiàn)MSC-sEVs臨床應用，一個GMP級的生產(chǎn)過程是非常必要的。生產(chǎn)步驟的選擇取決于所需要的批量大小，并且sEVs的純度、一致性、安全性和穩(wěn)定性等評價指標，必須通過質量測試并加以確認。
生物反應器培養(yǎng)：
在細胞培養(yǎng)中，細胞密度可影響細胞行為和分泌物的性質。據(jù)報道，在較低密度下接種的細胞，細胞會產(chǎn)生更多的sEVs。所以為了能夠大規(guī)模生產(chǎn)MSC-sEV，生物反應器是很理想的設備。目前有三種主要的生物反應器類型，每一種都對生產(chǎn)MSC-sEVs產(chǎn)生獨特的影響:
2D表面的生物反應器
基于中空纖維的生物反應器
攪拌罐生物反應器 (必須在微載體上培養(yǎng)MSC)
雖然三種生物反應器都已用于MSC制備，但它們對sEV生產(chǎn)及功能的影響需要進一步研究。即使細胞在靜態(tài)下的培養(yǎng)條件完全成熟，也不能立馬轉移到生物反應器中，必須要再優(yōu)化培養(yǎng)條件。3D生物反應器更有利于MSC的培養(yǎng)，因為它可以監(jiān)測細胞數(shù)量、生存能力、形態(tài)和增殖，并提供更均勻的營養(yǎng)和氧氣的分布。
細胞培養(yǎng)基成分：
MSC在胎牛血清(FBS)為能量來源的培養(yǎng)基中很容易生長，但是，為了促進MSC-EV在治療應用的發(fā)展，至少應該在sEV生產(chǎn)制備階段消除異種成分。因此，可以用人血清或血小板裂解液(hPL)來替代FBS。但與FBS一樣，人血清和hPL本身都含有EV或EV樣顆粒，它們可以與MSCs產(chǎn)生的sEVs共同被純化。這些外源性EVs可能是安全的，因為富含EVs的輸血產(chǎn)品大都是安全。但事實上，目前尚無證據(jù)表明hPL-EV對MSC-EV制劑的治療作用是否負性影響，而且外源性的sEVs或非sEVs顆?？赡軙档突蜃钄郙SC-sEVs的某些作用。因此，確定外源性囊泡與MSC-sEVs在治療作用上的關系是非常有必要的。
超速離心法：
超速離心法是目前應用最廣泛的EV富集方法。然而，超離心法有幾個缺點。超離心法不能產(chǎn)生高純度的sEVs，雖然系列洗滌可以提高純度，但同時也會降低產(chǎn)量。有報道稱超離后的sEV有聚集的現(xiàn)象，影響其電鏡下的形態(tài)。最重要的是，超速離心由于儀器的限制，不能高通量提取，且費時費力。所以超速離心不可能對MSC-sEV進行大規(guī)模純化。
商業(yè)試劑盒提取
近年來，隨著EV研究領域的發(fā)展，針對EV的商業(yè)產(chǎn)品數(shù)量激增。雖然這些產(chǎn)品中的一些已被認可，甚至潛在的符合GMP，但對許多產(chǎn)品來說，分離方法的原理并沒有被闡明，而且一些專有試劑的成分也不為人所知。除非產(chǎn)品的原理及操作已證明符合GMP要求，且商業(yè)試劑盒供應商披露了專有試劑成分，并評估該成分的臨床可用性和安全性，否則使用此類試劑盒生產(chǎn)臨床級的sEVs是不現(xiàn)實的。
聚乙二醇聚合物沉淀：
用聚乙二醇(PEG)或其他聚合物“鹽析”沉淀是減少樣本體積，達到濃縮目的的有效方法，而且樣本處理量很大，一次可以提取幾升細胞上清的EV，且操作簡單，只需要低速離心就可以獲得大量的EV，但是，聚乙二醇沉淀的EV中含有大量的共沉淀物，PEG沉淀不能獲得純凈的EV。然而，PEG-沉淀的MSC-sEVs已經(jīng)用于臨床研究，PEG濃縮的MSC-sEVs在缺血性腦卒中模型中的作用與相應的MSC效果相同。因此，PEG沉淀似乎不會干擾MSC-sEV活性。
依據(jù)顆粒大小分離：
基于EV粒徑大小的分離方法，如尺寸排阻色譜法(SEC)和切向流過濾法(TFF)，被越來越受到研究人員的認可。與傳統(tǒng)方法相比，這些方法更容易實現(xiàn)，同時還可以生產(chǎn)高純度的EV和而且不影響其生物活性，所以SEC和TFF被認為是高產(chǎn)高效的EV提取方法，其生產(chǎn)流程更容易標準化，適合GMP級的EV的生產(chǎn)。
我們目前對MSC-sEVs的定義僅僅傳達了EV的特性和生物完整性，并不能預測其治療效果。因此，開發(fā)一系列可定量、可靠的能夠預測MSC-EVs治療效力的的指標是十分必要的。檢測MSC-sEV的治療活性也需要對MSC-sEV生物學有深入的了解，例如正常和病變狀態(tài)下MSC-sEVs的半衰期和體內生物分布，以及對不同組織的直接或間接靶向等內容。因此，定義MSC-sEV制劑的治療效能需要更深層次的討論，這也是SOCRATES、ISCT、ISEV和ISBT未來探索的主題。
文章來源：
Defining mesenchymal stromal cell (MSC)-derived small extracellular vesicles for therapeutic applications. Journal Extracellular Vesicles. 2019