基因HVBO||敲除細(xì)胞株(系)構(gòu)建，用質(zhì)粒？慢病毒？還是RNP法？
眾所周知，CRISPR-Cas9作為一項(xiàng)基因編輯技術(shù)，目前已經(jīng)是生命科學(xué)領(lǐng)域家喻戶曉的技術(shù)了。但雖說(shuō)這項(xiàng)技術(shù)非?；鸨杂性S多同學(xué)對(duì)基因編輯技術(shù)存在理解偏差，比如最常見(jiàn)的，在應(yīng)用CRISPR-Cas9構(gòu)建基因敲除（KO）細(xì)胞系，到底采用質(zhì)粒法、病毒法還是有其他更好的方法呢？
★慢病毒法★
指通過(guò)包膜蛋白與細(xì)胞表面受體結(jié)合的方式感染細(xì)胞。即慢病毒與宿主細(xì)胞膜融合后釋放結(jié)構(gòu)蛋白、酶蛋白和病毒基因組。病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄并與整合酶形成整合前復(fù)合物。整合前復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核后，整合酶催化其整合至宿主基因組。具體方法是將包裝質(zhì)粒、穿梭質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48-72 h收集病毒上清，通過(guò)離心、過(guò)濾、濃縮、分裝和滴度檢測(cè)，進(jìn)而感染靶細(xì)胞。此方法會(huì)引入外源基因，影響其他基因表達(dá)，并且存在脫靶效應(yīng)。
圖1.慢病毒法原理圖
但是，慢病毒感染存在著兩個(gè)比較關(guān)鍵的問(wèn)題：
1. 利用慢病毒法轉(zhuǎn)染Cas9會(huì)在敲除靶基因的同時(shí)引入新的基因，而且慢病毒轉(zhuǎn)染的外源基因是隨機(jī)整合，存在影響其他基因表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)。
2. CRISPR-Cas9編輯過(guò)程存在脫靶效應(yīng)，慢病毒法會(huì)持續(xù)表達(dá)Cas9蛋白，長(zhǎng)期存在的Cas9蛋白會(huì)對(duì)這種脫靶效應(yīng)有累積效應(yīng)，最終影響實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性。
圖2. 慢病毒感染進(jìn)行基因敲除
★質(zhì)粒法★
將Cas9和sgRNA表達(dá)載體，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方式感染靶細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)翻譯出Cas9蛋白，與轉(zhuǎn)錄的sgRNA結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞核對(duì)基因組進(jìn)行編輯。具體方法是將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫靜置，轉(zhuǎn)染體系加入靶細(xì)胞培養(yǎng)，再進(jìn)行單克隆篩選、單克隆擴(kuò)增、qPCR檢測(cè)等。由于質(zhì)粒整合到基因組的概率很低，隨著細(xì)胞傳代質(zhì)粒載體會(huì)逐漸消失，感染效率逐漸降低。
圖3.質(zhì)粒法原理圖
★RNP法★
與質(zhì)粒法不同的是，RNP法是通過(guò)電刺激轉(zhuǎn)染的方法直接將Cas9蛋白和sgRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。由于Cas9蛋白是不帶電荷的，而sgRNA是帶電荷的，因此只有當(dāng)Cas9與sgRNA結(jié)合后，才能更高效的將兩者轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。同時(shí)，由于Cas9和sgRNA會(huì)被降解，Cas9-sgRNA復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的存留時(shí)間不會(huì)很長(zhǎng)，因此發(fā)生脫靶的概率很低，但相應(yīng)的切割效率也可能有一定降低。
圖4.RNP轉(zhuǎn)染原理圖
圖2. Cas9蛋白與gRNA形成RNP復(fù)合物
從國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的情況來(lái)看，質(zhì)粒法和RNP法是目前主流的基因敲除策略，對(duì)于課題組實(shí)驗(yàn)室而言，質(zhì)粒法可能更容易實(shí)施，而對(duì)于生物技術(shù)企業(yè)，RNP法則具有更高的實(shí)驗(yàn)效率。但這兩種不同的方法只是殊途同歸，只要能達(dá)到敲除效果的就是好方法。
山東華博基因工程有限公司（簡(jiǎn)稱華博基因），起源于2018年，是一家致力于為客戶提供全流程動(dòng)植物分子育種系統(tǒng)解決方案，集研發(fā)、設(shè)計(jì)、生產(chǎn)、銷(xiāo)售為一體的高新技術(shù)企業(yè)。核心業(yè)務(wù)：基因編輯和分子標(biāo)記輔助育種、基因組測(cè)序、基因定位克隆、蛋白互作、代謝組分析、基因組數(shù)據(jù)挖掘等技術(shù)服務(wù)，以及土壤、水分和種子等檢測(cè)服務(wù)。
華博基因擁有先進(jìn)的理念和技術(shù)，專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)，滿足客戶需求。歡迎來(lái)電咨詢，我們將第一時(shí)間接聽(tīng)您的來(lái)電：0531-86095877！