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09-18
2023
知識梳理||常用基因組DNA提取方法
發(fā)布者:本網(wǎng)站 瀏覽次數(shù):687
常用基因組DNA提取方法
一、CTAB法
CTAB（十六烷基三甲、基溴化銨），是一種陽離子型表面活性劑，可溶解細(xì)胞膜使細(xì)胞裂解。在高鹽溶液中（>0.7mol/L NaCl），CTAB可與蛋白質(zhì)和中性多糖形成復(fù)合物而沉淀，不能沉淀核酸和酸性多糖，另外它還能保護(hù)DNA不受內(nèi)源核酸酶的降解。CTAB法是植物基因組DNA最經(jīng)典的提取方法。
1、Tris-HCl （pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；
2、EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；
3、NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解于液相中；
4、CTAB裂解細(xì)胞，沉淀蛋白和中性多糖；
5、PVP（聚乙、烯吡、咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，6、有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它對多糖的去除也有一定的作用；
7、β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除；
8、蛋白酶K用于生物樣品中蛋白質(zhì)的一般降解，將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子分離出來。
優(yōu)點(diǎn)：所需體積小且速度快，適用于濃度低，而體積大 DNA 樣品的沉淀。0.54~1.0倍體積的異丙醇可選擇性沉淀DNA和大分子RNA；但對多糖產(chǎn)物不產(chǎn)生沉淀，一般不需要在低溫條件下長時間放置；
缺點(diǎn)：易使鹽類（如 NaCl、蔗糖）與DNA共沉淀；在DNA沉淀中異丙醇難以揮發(fā)除去，所以常規(guī)需要用70％的乙醇漂洗DNA沉淀數(shù)次。
2、乙醇
優(yōu)點(diǎn)：對鹽類沉淀少，DNA沉淀中所含的痕量乙醇易蒸發(fā)出去，不影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)；
缺點(diǎn)：是總體積較大，在適當(dāng)?shù)柠}濃度下， 2倍樣品體積的95％乙醇可有效沉淀 DNA需在-20度放置較長時間（30分鐘-1小時）同樣需要70%乙醇洗滌。
二、CTAB+過柱法
核酸純化柱（Spin column）可以用于各種材料的DNA\RNA的提取以及精制。具有操作簡單、回收率高、性能穩(wěn)定等特點(diǎn)，目前產(chǎn)品已經(jīng)為國內(nèi)外大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室和公司使用。核酸純化柱（Spin column）采用硅膠膜作為核酸的特異性吸附材料，而對其他生物材料基本不吸附，可以保障******、程度地回收樣品中的DNA\RNA，同時去除其他雜質(zhì)。對于雜質(zhì)組份不清楚，雜質(zhì)含量較多的樣品，可考慮采用CTAB裂解，然后過柱純化的方式進(jìn)行提取，一般可顯著改善提取樣品的純度。
三、SDS法
SDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子型表面活性劑，可使細(xì)胞膜崩解，與膜蛋白疏水部分結(jié)合并使其與膜分離，高濃度的SDS還可以破壞蛋白質(zhì)中的離子鍵和氫鍵等非共價鍵，甚至改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象。SDS法適用于動物組織、血液、細(xì)胞、細(xì)菌和酵母等DNA的提取。
四、環(huán)境微生物提取方法
環(huán)境微生物(Environmental microorganism)通常是指大量的、極其多樣的存在于自然界的一大群體形微小、結(jié)構(gòu)簡單、肉眼直接看不見，必須借助光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡放大數(shù)百倍、數(shù)千倍，甚至數(shù)萬倍才能觀察到的微小生物。
直接利用各種化學(xué)或物理方法裂解土壤樣品中的微生物再提取總DNA。優(yōu)點(diǎn)是避免了一些微生物與土壤顆粒共沉淀，從而提高DNA產(chǎn)量，能更好的反映土壤微生物群落多樣性；缺點(diǎn)在于提取的同時將土壤中有機(jī)成分（如腐殖酸等）溶出，影響了后續(xù)分析。
采用直接法的常用試劑盒：
Qiagen的DNeasy Powersoil Kit可用于土壤微生物總DNA提取；
Qiagen的QIAamp Stool Mini kit可用于糞便、腸內(nèi)容物、生物固體總DNA提取。
2、間接提取法
先采用差速離心等物理方法將微生物從樣品中分離出來，再用較溫和的方法提取總DNA。缺點(diǎn)是有一些微生物因與土壤顆粒共沉淀而導(dǎo)致它們在后續(xù)分析過程中被“漏檢”。
江河湖泊等自然水體中微生物的含量一般較低，為了提取足夠量的DNA，需要對大體積水體中的微生物進(jìn)行濃縮處理，一般采用0.22um濾膜過濾后，將過濾后的濾膜或者洗脫濾膜的緩沖液進(jìn)行DNA提取。
2、離心法
對于培養(yǎng)的菌液等微生物含量較高的水體類樣品，可采用離心法將菌體細(xì)胞沉淀下來后進(jìn)行提取。一些生物液體如奶、腦脊液、胸腔液等也可用此方法進(jìn)行微生物收集。
好的，以上就是常用基因組DNA提取方法，需要強(qiáng)調(diào)的是，上面提到的一些DNA提取方法及策略并不是一成不變的，在實(shí)際工作中我們可以根據(jù)所提取材料的不同、提取結(jié)果的差異，靈活調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案，目的只有一個，提取到純度高、完整性好、得率高的DNA樣品，以滿足我們后續(xù)的科研需求。
一、CTAB法
CTAB（十六烷基三甲、基溴化銨），是一種陽離子型表面活性劑，可溶解細(xì)胞膜使細(xì)胞裂解。在高鹽溶液中（>0.7mol/L NaCl），CTAB可與蛋白質(zhì)和中性多糖形成復(fù)合物而沉淀，不能沉淀核酸和酸性多糖，另外它還能保護(hù)DNA不受內(nèi)源核酸酶的降解。CTAB法是植物基因組DNA最經(jīng)典的提取方法。
CTAB裂解液組份及各組份的作用
1、Tris-HCl （pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；
2、EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；
3、NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解于液相中；
4、CTAB裂解細(xì)胞，沉淀蛋白和中性多糖；
5、PVP（聚乙、烯吡、咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，6、有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它對多糖的去除也有一定的作用；
7、β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除；
8、蛋白酶K用于生物樣品中蛋白質(zhì)的一般降解，將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子分離出來。
抽提DNA去除蛋白質(zhì)時，怎樣使用酚與氯、仿較好？
為什么用酚與氯、仿抽提DNA時，還要加少量的異、戊醇？
乙醇沉淀和異丙醇沉淀各有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？
優(yōu)點(diǎn)：所需體積小且速度快，適用于濃度低，而體積大 DNA 樣品的沉淀。0.54~1.0倍體積的異丙醇可選擇性沉淀DNA和大分子RNA；但對多糖產(chǎn)物不產(chǎn)生沉淀，一般不需要在低溫條件下長時間放置；
缺點(diǎn)：易使鹽類（如 NaCl、蔗糖）與DNA共沉淀；在DNA沉淀中異丙醇難以揮發(fā)除去，所以常規(guī)需要用70％的乙醇漂洗DNA沉淀數(shù)次。
2、乙醇
優(yōu)點(diǎn)：對鹽類沉淀少，DNA沉淀中所含的痕量乙醇易蒸發(fā)出去，不影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)；
缺點(diǎn)：是總體積較大，在適當(dāng)?shù)柠}濃度下， 2倍樣品體積的95％乙醇可有效沉淀 DNA需在-20度放置較長時間（30分鐘-1小時）同樣需要70%乙醇洗滌。
富含多糖多酚植物高質(zhì)量基因組DNA提取的難點(diǎn)
二、CTAB+過柱法
核酸純化柱（Spin column）可以用于各種材料的DNA\RNA的提取以及精制。具有操作簡單、回收率高、性能穩(wěn)定等特點(diǎn)，目前產(chǎn)品已經(jīng)為國內(nèi)外大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室和公司使用。核酸純化柱（Spin column）采用硅膠膜作為核酸的特異性吸附材料，而對其他生物材料基本不吸附，可以保障******、程度地回收樣品中的DNA\RNA，同時去除其他雜質(zhì)。對于雜質(zhì)組份不清楚，雜質(zhì)含量較多的樣品，可考慮采用CTAB裂解，然后過柱純化的方式進(jìn)行提取，一般可顯著改善提取樣品的純度。
三、SDS法
SDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子型表面活性劑，可使細(xì)胞膜崩解，與膜蛋白疏水部分結(jié)合并使其與膜分離，高濃度的SDS還可以破壞蛋白質(zhì)中的離子鍵和氫鍵等非共價鍵，甚至改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象。SDS法適用于動物組織、血液、細(xì)胞、細(xì)菌和酵母等DNA的提取。
SDS裂解液組份及各組份的作用
四、環(huán)境微生物提取方法
環(huán)境微生物(Environmental microorganism)通常是指大量的、極其多樣的存在于自然界的一大群體形微小、結(jié)構(gòu)簡單、肉眼直接看不見，必須借助光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡放大數(shù)百倍、數(shù)千倍，甚至數(shù)萬倍才能觀察到的微小生物。
環(huán)境微生物的分類
土壤微生物類樣品總DNA提取策略
直接利用各種化學(xué)或物理方法裂解土壤樣品中的微生物再提取總DNA。優(yōu)點(diǎn)是避免了一些微生物與土壤顆粒共沉淀，從而提高DNA產(chǎn)量，能更好的反映土壤微生物群落多樣性；缺點(diǎn)在于提取的同時將土壤中有機(jī)成分（如腐殖酸等）溶出，影響了后續(xù)分析。
采用直接法的常用試劑盒：
Qiagen的DNeasy Powersoil Kit可用于土壤微生物總DNA提取；
Qiagen的QIAamp Stool Mini kit可用于糞便、腸內(nèi)容物、生物固體總DNA提取。
2、間接提取法
先采用差速離心等物理方法將微生物從樣品中分離出來，再用較溫和的方法提取總DNA。缺點(diǎn)是有一些微生物因與土壤顆粒共沉淀而導(dǎo)致它們在后續(xù)分析過程中被“漏檢”。
水體微生物類樣品總DNA提取策略
江河湖泊等自然水體中微生物的含量一般較低，為了提取足夠量的DNA，需要對大體積水體中的微生物進(jìn)行濃縮處理，一般采用0.22um濾膜過濾后，將過濾后的濾膜或者洗脫濾膜的緩沖液進(jìn)行DNA提取。
2、離心法
對于培養(yǎng)的菌液等微生物含量較高的水體類樣品，可采用離心法將菌體細(xì)胞沉淀下來后進(jìn)行提取。一些生物液體如奶、腦脊液、胸腔液等也可用此方法進(jìn)行微生物收集。
好的，以上就是常用基因組DNA提取方法，需要強(qiáng)調(diào)的是，上面提到的一些DNA提取方法及策略并不是一成不變的，在實(shí)際工作中我們可以根據(jù)所提取材料的不同、提取結(jié)果的差異，靈活調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案，目的只有一個，提取到純度高、完整性好、得率高的DNA樣品，以滿足我們后續(xù)的科研需求。
山東華博基因工程有限公司（簡稱華博基因），起源于2018年，是一家致力于為客戶提供全流程動植物分子育種系統(tǒng)解決方案，集研發(fā)、設(shè)計、生產(chǎn)、銷售為一體的高新技術(shù)企業(yè)。
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