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免疫組織熒光，一定******冰凍切片而非石蠟切片。兩者的區(qū)別主要在于冰凍切片能較完整地保存抗原免疫活性，但組織結(jié)構(gòu)會(huì)受到冰晶等的影響而變形，石蠟切片則相反。雖然石蠟切片可以做抗原修復(fù)，但是會(huì)比較麻煩。

4% PFA 動(dòng)物心臟灌注。

如今實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多為嚙齒動(dòng)物，以 SD 大鼠為例：麻醉，固定頭和四肢，開胸腔，暴露心臟，灌流針插入左心尖（也就是左心室），右心耳剪個(gè)小口同時(shí)打開蠕動(dòng)泵開關(guān)開始灌流，先 PBS 后 PFA，最后解剖目標(biāo)組織于 4% PFA 中浸泡，4 度 24 h。

麻醉和開胸腔不用說。灌流針插入心尖的時(shí)候，理論上應(yīng)插到主動(dòng)脈附近，但實(shí)際上此操作很容易插錯(cuò)從而進(jìn)入肺循環(huán)導(dǎo)致灌流失敗，所以此時(shí)可以使針尖剛剛穿過心尖到達(dá)左心室即可。

接著，右心耳剪口，開啟灌注，兩者保持一致。

注意：灌流時(shí)管道不允許有氣泡。PBS 灌流結(jié)束標(biāo)志以肝臟變白和流出澄清液體為準(zhǔn)，PFA 灌流成功標(biāo)志位肝臟變硬為準(zhǔn)，灌得好的大鼠四肢會(huì)抽搐幾次，成年 SD 大鼠 250 ml PBS 和 250 ml PFA 足矣。

10%，20%，30% 蔗糖的 PBS 溶液梯度脫水。

脫水這一步直接關(guān)系到后面切片的冰晶的形成，脫水脫不好則冰晶較多，片子空洞較多，結(jié)果相當(dāng)丑。此時(shí)應(yīng)使溶液的體積超過數(shù)倍于組織的體積，沉底即可換液，直到組織塊在 30% 的蔗糖溶液中沉底。沉底后就不要放置太長時(shí)間了，應(yīng)迅速進(jìn)行下一步。

組織塊修好后放入合適的包埋盒，加入 OCT 包埋劑，液氮或干冰速凍，放入 -80 冰箱保存?，F(xiàn)在普遍用 OCT 包埋劑（optimal cutting temperature compound），是一種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，目前已廣泛用于免疫組化實(shí)驗(yàn)室中，其用途是在冰凍切片時(shí)支撐組織，以增加組織的連續(xù)性，減少皺折及碎裂。又因 OCT 混合物為水溶性，故在漂片時(shí)可溶于水，所以在以后的染色中不會(huì)增加背景染色。  

切片是一門學(xué)問，不練幾個(gè)月是沒法入門的。而且這也不是光看文字就能學(xué)會(huì)的。但萬變不離其宗，切出來的片子的好壞與你包埋的好壞、機(jī)器各部分之間的角度和距離等參數(shù)和你的操作習(xí)慣的好壞是密切相關(guān)的。

這里不說流程，簡單說幾個(gè)注意事項(xiàng)：

（1）修塊最好是矩形或梯形；

（2）切片時(shí)先慢后快；

（3）貼片時(shí)利用玻片對(duì)組織薄片的自然貼合力，不要用蠻力。貼片后稍稍晾干，-80 ℃ 保存。片子使用前最好在 -20 ℃ 復(fù)溫 1 h。

漂洗，封閉，敷一抗，漂洗，敷二抗，漂洗，封片，鏡檢。

所有的免疫熒光基本上就這一套流程。

如何洗？

溶液剛好浸沒載玻片，搖床漂洗，洗三次。不用怕掉片，只要你買的多聚賴氨酸預(yù)處理的載玻片質(zhì)量過關(guān)，在保質(zhì)期內(nèi)，一般不會(huì)掉。

然后封閉，封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，也可以用小牛血清，羊血清等，大多數(shù)二抗來源為羊，所以多數(shù)情況用羊血清沒問題，封閉液里也包含 0.2% triton-X100，通透作用，孵育室溫 1.5 h。一抗一般 4 ℃ 過夜，效果較好，還可以回收抗體，二抗可以室溫 1.5 h，此時(shí)的二抗都是熒光二抗，一定避光操作。

接下來，封片劑封片，不要有氣泡，然后鏡檢，保存可以放 -80 ℃。前文的漂洗液以及其他溶液的溶劑都為 PBS。

有幾點(diǎn)需要注意，全程的溶液孵育過程要用濕盒，或者用其他辦法保持片子的濕度以免溶液蒸發(fā)。所有步驟的時(shí)間都是可調(diào)的，各試劑的濃度也可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來變動(dòng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件環(huán)境溫度等。